簡 介：實時熒光定量PCR（Real -Time Quantitative PCR，又稱qPCR）是分析組織細(xì)胞中基因表達(dá)差異的最為準(zhǔn)確的實驗手段和方法。通過SYBR Green I或Taqman探針，實現(xiàn)對DNA或RNA的熒光定量PCR監(jiān)測, 達(dá)到對基因的相對定量、絕對定量和定性分析。
SYBR Green I染料法和Taqman探針法
簡 介：
SYBR Green I染料法：該染料是專一和雙鏈DNA分子結(jié)合發(fā)光的熒光染料，每擴增一次，染料結(jié)合一次，檢測信號增加一倍；
Taqman探針法：5末端連接熒光基團，3端末端連接猝滅基團，PCR擴增時，兩個基團相互分離，熒光基團得以檢測。
圖：SYBR Green I染料法作用原理
圖：Taqman探針法作用原理
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技術(shù)比較 |
擴增特異性 |
實驗成本 |
實驗選擇 |
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SYBR Green I染料法 |
稍低 |
稍低 |
主要用于基因表達(dá)水平差異研究 |
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Taqman探針法 |
較高 |
較高（主要是探針合成） |
主要用于微生物檢測中的準(zhǔn)確定量 |
技術(shù)優(yōu)勢：
◆ 采用進(jìn)口RNA提取試劑盒（柱提取法），同時采用DNase I上柱液去除殘余基因組DNA，
有效提高了RNA純度和定量的精確性。
◆ 采用優(yōu)化的高效逆轉(zhuǎn)錄體系，有效提高cDNA含量，尤其對特殊結(jié)構(gòu)或高GC序列的逆轉(zhuǎn)
錄效果顯著。
◆ 采用優(yōu)化的SYBR Green I qPCR Premix及Taqman qPCR Premix，有效提高擴增效率以及
減少非特異性擴增。
◆ 本公司注重對定量PCR引物及探針的設(shè)計及優(yōu)化，尤其是對內(nèi)參引物的選擇和優(yōu)化，有效提高定量PCR數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可靠性。
客戶須知：
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實時熒光定量PCR |
周期 |
最終提供客戶資料 |
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實時熒光定量PCR |
10-14個工作日（視樣品和基因數(shù)目而定） |
詳細(xì)實驗總結(jié)報告（包括引物序列、總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄實驗、擴增曲線、熔點曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線、樣品重復(fù)結(jié)果、相對表達(dá)分析結(jié)果，統(tǒng)計分析等） |
案 例：
1. 定量PCR每一步做到高標(biāo)準(zhǔn)和高質(zhì)量
2. 注重定量PCR內(nèi)參的選擇及優(yōu)化
許多科研人員及公司，隨便選擇一種內(nèi)參，根本不考慮內(nèi)參的穩(wěn)定與否，就進(jìn)行qPCR分析研究，往往得出與實際相反的結(jié)論。本公司針對每個模式生物，準(zhǔn)備了至少5種候選內(nèi)參基因引物，針對每一個qPCR實驗，采用gNorm或Normfinder軟件篩選最為穩(wěn)定的內(nèi)參引物，從而實現(xiàn)qPCR數(shù)據(jù)的可靠性和準(zhǔn)確性。
3. 善于質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備、稀釋，用于qPCR絕對定量分析
絕對定量中，最重要的莫過于質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備及優(yōu)化，許多科研人員或公司簡單的構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，然后進(jìn)行稀釋，往往導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線制備較差。本公司善于選取有效的PCR擴增片段，同時優(yōu)化合適的qPCR引物，采用有效的對標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋，實現(xiàn)qPCR絕對定量的精確性。
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